Но интереснее наблюдать и изучать то, что уже есть у нас под рукой в частном доме, в квартире и во дворе. Исследование того, что нас ежедневно окружает, дарит поистине яркие впечатления. Поэтому позаботьтесь о доступных средствах наблюдения и об объектах.
Что обычно исследует домашняя микроскопия?
Самые простые варианты:
- растения – листья, стебли, корни;
- овощи, фрукты, ягоды;
- насекомые;
- микроорганизмы;
- кристаллы.
Растения и их плоды
В домашних условиях можно начать изучение микромира с обычного репчатого лука, точнее с его кожуры. Ее структура тонкая и хорошо проглядывается даже под . Но кожицу надо заранее подкрасить йодом. Иногда можно обойтись и зеленкой. Рекомендуем при этом использовать специальные бюксы либо часовые стекла.
Исследование лука
- Приготовьте микроскоп, настройте свет. Протрите предметное и покровное стекла салфеткой. Капните слабый раствор йода и воды на предметное стекло.
- Разрежьте луковицу, снимите чешую. С мясистой части луковицы сорвите кусочек пленки пинцетом и положите его в созданную каплю на стекле.
- Расправьте приготовленную кожицу на стекле.
- Накройте препарат покровным стеклом.
- Ваш временный препарат готов!
- Наблюдайте препарат под увеличением 64x (объектив х4, окуляр х16). Двигайте предметное стекло, пока не найдете подходящее место, где лучше всего различимы продолговатые клетки.
- Увеличьте кратность до 400 раз (объектив 40x, окуляр 10x).
Большое увеличение позволяет рассмотреть плотную прозрачную оболочку с более тонкими участками – порами. Внутри клетки находится бесцветное вязкое вещество – цитоплазма, окрашенная йодом. В цитоплазме Вы заметите небольшое плотное ядро, где находится ядрышко. В большинстве клеток, особенно в старых, хорошо различимы полости – вакуоли.
Рис. Фотографии получены с помощью микроскопа
Под микроскопом Вы увидите в строении кожуры чётко различимые ядра клеток. Конечно, большинство взрослых такой эксперимент уже проводили в школе, но самым юным исследователям такой анализ растения будет в новинку.
Кожура фруктов и ягод тоже подойдет для изучения под микроскопом. Однако клеточное строение таких препаратов для исследования может быть неразличимым, особенно при использовании маломощных приборов. Плюс потребуется немало усилий и много попыток до того, как получится идеальный препарат. Попытайтесь, например, срезать несколько раз кожицу со сливы, пока не выйдет подходящий многоклеточный слой. Или переберите сразу несколько сортов винограда (благо сегодня в гипермаркетах можно купить даже по несколько ягодок разных растений), пока не найдете тот, у которого красящие вещества кожуры имеют интересную форму.
Дальше переходите к клубням картофеля, которые тоже нужно окрашивать йодом согласно описанной выше процедуре. Но перед этим нарежьте картошку тончайшими ломтиками. Далее, из-за реакции с йодом на картошке проявятся пласты крахмала синего цвета.
Но самые доступные для исследований растения вроде листьев, травы или зеленых водорослей (найдете их в любых открытых водоемах). Чтобы увидеть хлоропласты, делайте срезы исключительно тонкими.
Хлоропласты – это зелёные пластиды, встречающиеся в клетках фотосинтезирующих эукариот. Фотосинтез происходит именно с их помощью.
Насекомые и представители водной фауны
Надоело смотреть на растения? Переходите к летающей и ползающей живности. Даже из квартиры не надо выходить. На балконе и под москитными сетками обычных окон, а также на ветровом стекле автомобиля собирается множество букашек, в том числе уже почивших. Это все ценный материал для Ваших исследований. На крыльях насекомых Вы увидите волоски, защищающие букашек от промокания. Поверхностное натяжение капли воды не дает ей коснуться крылышек. Приглядитесь!
Помните, как в детстве Вы ловили бабочек? А Вы не задумывались, что за пыль осыпается с ее крылышек?! Это микроскопические чешуйки разной формы, которые мы, как титаны, срываем небрежным касанием пальцев. Если вдруг поймаете моль, то используйте ее вместо бабочки.
Дальше присмотритесь к конечностям насекомых и пауков, изучите хитиновое строение пленки спины таракана. Вы удивитесь, но большое увеличение микроскопа поможет и здесь разглядеть сросшиеся чешуйки, из которых и состоят подобные пленки.
Естественно, не всем интересно смотреть на тараканов, поэтому просто выйдите на улицу, где поймать диковинное насекомое проще. Также загляните в ближайший водоем, в котором Вы обязательно отыщите мальков улитки, амеб, дафний (планктонных ракообразных), туфелек и циклопов. Малюсенький и оптически прозрачный детеныш улитки лучше всего подходит для изучения сердцебиения.
Рассмотрим пример исследования под микроскопом простейших живых организмов (из любого уличного водоема или домашнего аквариума), которые состоят всего из одной клетки:
- Возьмите из комплекта стекол предметное стекло с лункой. Очистите и обезжирьте его путем кипячения в слабом содовом растворе (чайная ложка на литр воды), а потом высушите досуха.
- Уложите в лунку несколько волокон ваты. Это замедлит исследуемых простейших.
- Пипеткой поместите воду на предметное стекло.
- Смажьте края покровного стекла парафином или вазелином (для предотвращения испарения влаги) и накройте им лунку основного стекла.
Можно проводить эксперимент с помощью обычных стекол без углубления – исследование в «раздавленной» капле. Чтобы не деформировать объект, гранями верхнего стекла проведите по пчелиному воску, образуя таким образом «ножки». По центру нижнего стекла разместите тончайший слой волокон ваты либо фильтрованной бумаги. Закройте препарат так, чтобы под верхнее стекло не попал воздух: подводим под углом нижнюю грань покровного стекла и плавно опускаем. В обоих случаях должна образоваться герметичная камера, в которой исследуемая жидкость долго не высыхает.
Не забывайте окрашивать препараты для лучшего наблюдения. Лучшим витальным красителем без токсического действия является нейтральный красный в концентрации не более 1 к 200 000. Неплохие результаты дает слабый щелочной раствор конго красного. Реактивы позволяют детально изучить простейших, не нарушая при этом их ритм жизни.
Освещение тоже важно! Для изучения живых организмов в готовых препаратах немного затемняйте поле зрения. В ярком проходящем свете важные аспекты строения простейшего почти неразличимы. Работу с увеличительным прибором следует начать с установки слабого увеличения при суженной диафрагме. После поэтапно увеличивайте картинку, поворачивая револьвер с объективами и настраивая механизм фокусировки.
В итоге запасайтесь баночками и пакетиками при любой вылазке на природу. В банку можно набрать воды из водоема, а в пакет заключить сорванные растения и высохшие останки насекомых. Соблюдайте осторожность, помня, что животные и их останки могут нести в себе различные заболевания. Надевайте перчатки, мойте руки и соблюдайте остальные правила элементарной гигиены.
Далеко не всё, что есть под рукой, имеет смысл класть на предметный столик и пытаться рассмотреть в окуляр микроскопа. Например, непрозрачные объекты (палец, монета) рассмотреть совсем не удастся, да и для рассматривания вполне достаточно сильной лупы.
Обычно для микроскопирования используют специально приготовленные микропрепараты. При приготовлении микропрепарата берется предметное стекло (размер 25 × 75 мм), на которое помещается рассматриваемый объект; обычно для лучшей сохранности и удобства использования объект накрывается сверху тонким покровным стеклом (размер 18 × 18 мм).
По способу приготовления и времени хранения различают:
- постоянные препараты – объект помещен в прозрачную твердеющую среду (обычно канадский бальзам) и накрыт покровным стеклом; такие препараты могут храниться годами и десятилетиями, однако их приготовление весьма трудоемко (объект должен быть тщательно подготовлен: обезвожен, окрашен и др.);
- временные препараты – объект помещен в жидкую среду (вода, физиологический раствор, глицерин-желатин и др.), такие препараты годны для использования в течение нескольких часов, однако с ними можно проводить опыты (например, заменять воду солевым раствором определенной концентрации, добавлять краситель и др.).
Постоянный препарат |
В таблице представлены типы препаратов в зависимости от характера исследуемого объекта.
Описание |
Постоянный/ временный |
Пример |
||
Тотальный препарат |
Целый организм или его небольшие части (конечности, ротовой аппарат). Обычно требуют обработки (осветления) |
Постоянный, временный |
 |
|
Объект заливается в пластичный материал (парафин, акрил) и после его затвердевания разрезается на тонкие пластины с помощью микротома (приспособления для получения тонких срезов) |
Обычно постоянный |
 |
||
Токослойный препарат без покровного стекла (обычно препарат крови): капля с помощью полированного стекла размазывается по поверхности предметного стекла тонким слоем, высушивается |
Временный, реже постоянный |
 |
||
Тонкая (толщина 0,03-0,02 мм) пластинка горной породы или другого твердого образца (кости, окаменелости), приклеенная к покровному стеклу |
Постоянный |
 |
В некоторых случаях временный препарат можно рассматривать непосредственно, не накрывая покровным стеклом. Такой препарат будет практически невозможно рассмотреть резко сразу весь – какая-то часть его будет в фокусе, а остальное – нет. Но если рассматривать такой препарат с малым увеличением микроскопа, можно рассмотреть некоторые интересные объекты.
Так же в виде открытых временных препаратов можно вырастить кристаллы разных солей (ацетилсалициловой кислоты, или аспирина; медного купороса, или сульфата меди; красной кровяной соли, или гексацианоферрата калия). На предварительно очищенное от пыли и отпечатков пальцев наносится несколько капель водного или спиртового раствора соли (для лучшего качества кристаллов раствор предварительно лучше профильтровать, так как это позволит уменьшить количество точек кристаллизации и получить более крупные и аккуратные кристаллы). Каплям дают высохнуть (можно провести эксперимент с одним из стекол, нагрев его, с целью ускорения выпаривания, а другому дать растворителю испариться, а кристаллам – выпасть самостоятельно). Также можно рассматривать полуготовый микропрепарат на этапе процесса кристаллизации: можно увидеть, как кристалл увеличивается прямо на глазах или как вокруг зародыша твердого вещества возникает течение жидкости из-за разницы концентраций ионов.
Простой и эффектный способ изготовления микропрепаратов без срезов, позволяющий рассмотреть рельеф поверхности изучаемого объекта (например, листа растения, покровов тела насекомого) – метод реплик . При этом берется объект (например, лист растения), и на него наносится тонкий слой прозрачного лака для ногтей (достаточно небольшого пятна 5 × 10 мм). После того, как лак высохнет (примерно через 5-7 минут), к лаковому пятну приклеивается кусок липкой ленты; так реплика отделяется, после чего ее кладут на предметное стекло и рассматривают под микроскопом.
1.1. Приготовление временного препарата
Техника приготовления временного препарата хорошо известна по школьным опытам с кожицей лука. Кладем предметное стекло на стол (препараты всегда держат за боковые грани предметного стекла). В центр стекла помещаем 1-2 капли воды и объект исследования Берем покровное стекло за боковые грани и осторожно накрываем им сверху каплю с объектом. Правильнее упереть покровное стекло одной из граней в предметное и медленно уменьшать угол между стеклами так, чтобы накрыть каплю с объектом. Это уменьшает возможность появления пузырьков воздуха.
1.2. Приготовление мазка крови
Мазки крови для исследования крови готовят следующим образом.
| Шаг | Описание |
Фотография |
Поместите небольшую каплю крови на лежащее на горизонтальной поверхности предметное стекло, с помощью стеклянной капиллярной пипетки (или непосредственно из места укола пальца перенесите выступившую каплю крови на конец стерильного предметного стекла, стараясь не касаться стекла проколотым участком кожи). |
 |
|
Чистое шлифованное стекло помещается коротким ребром под углом 45° к предметному стеклу у края капли. Ждем, пока кровь расплывется под ребром стекла. |
  |
|
Как только кровь растеклась по ребру, быстрым движением от капли проводим по предметному стеклу. Не следует сильно нажимать на стекло, так как при этом могут разрушиться форменные элементы крови. |
 |
|
После приготовления мазок быстро сушат на воздухе до исчезновения влажного блеска, подержав его над абажуром лампы или помахав им в воздухе. Хорошо сделанный мазок тонок, имеет желтоватый цвет и оканчивается «метелочкой». Густо-розовые и красноватые мазки непригодны, так как они слишком толстые и клеточные элементы различить будет сложно. |
 |
Изображения и описание с сайта microtome.info/documents/micropreparaty.html .
2. Некоторые особенности микроскопирования
Использование микроскопов на малом и большом увеличении достаточно хорошо известно по школьным опытам и не требует особо сложных навыков.
2.1. Имерсионный объектив
Если в ващем распоряжении имеется микроскоп с иммерсионным объективом (он маркируется 100× МИ и черным кольцом, и имеет подвижную часть объектива, обращаемую к микропрепарату), то у вас есть возможность рассмотреть объекты с большим увеличением (однако для этого имеет смысл использовать мазки).
Порядок работы с объективом масляной иммерсии следующий.
- Выведите из хода лучей сухой объектив (поверните барабан объективов так, чтобы ни один объектив не был обращен к препарату).
- На препарат нанесите одну каплю иммерсионного (кедрового) масла; желательно иммерсионным маслом также немного смазать линзу этого объектива.
- Повернув барабан объективов, введите иммерсионный объектив в ход лучей (до щелчка фиксации).
- Опустите объектив до соприкосновения с каплей иммерсионного масла, затем, наблюдая в микроскоп, с помощью винтов грубой и точной фокусировки, произведите настройку на резкость.
При работе с иммерсионным объективом потребуется максимальная освещенность. После окончания исследования иммерсионный объектив нужно протереть мягкой оптической тряпочкой или батистовой, слегка смоченной специальной жидкостью для чистки оптики. Важно: любые другие виды объективов протирать нельзя!
Применение вместо кедрового масла других масляных жидкостей не рекомендуется, т. к., если показатель преломления используемой иммерсии (например, вазелинового масла с показателем 1,48162) отличается от показателя преломления кедрового масла (показатель 1,515), возможно снижение контраста, нечеткость изображения, уменьшение разрешающей способности.
2.2. Фотографии в косом освещении и темном поле
Для объемных препаратов (тотальные препараты насекомых, водорослей и др.) интересно использовать освещение, отличное от обычного просвечивающего. Для регулировки освещения в микроскопах используется конденсор – поворотное устройство с отверстиями разного диаметра и расположения. Используя специальные варианты конденсора, можно изменить характер освещения препарата, подчеркнув объем рассматриваемого объекта.
В таблице сравнивается работа с освещением разных типов.
Тип освещения |
Способ создания |
Вид зрачка объектива с вынутым окуляром |
Пример |
|
Обычное (просвечи-вающее) |
Свет проходит через поле зрения равномерно. |
 |
 |
|
Окраска по Граму.
1 этап - приготовление мазка.
Предметное стекло обжигают в пламени газовой горелки. Восковым карандашом отмечают пределы будущего мазка в виде окружности диаметром 1-2 см. и кладут стекло на стол. Прокаленной петлёй наносят в середину кружка небольшую каплю стерильного изотонического раствора хлорида натрия (ИХН). Затем в эту каплю вносят небольшое количество культуры бактерий, тщательно эмульгируют и распределяют тонким слоем в пределах кружка. Мазки из бульонных культур готовят без предварительного нанесения ИХН.
2 этап - высушивание.
Стекло оставляют на воздухе до исчезновения влаги.
3 этап - фиксация.
Фиксацию проводят для того, чтобы убить микробы, прикрепить их к стеклу, повысить их восприимчивость к красителям. Для фиксации предметное стекло (мазком вверх) трижды накладывают на пламя горелки на 2-3 секунды с интервалом 4-6 секунд. Мазки из гноя, крови, мокроты, отечной жидкости фиксируют погружением в фиксирующие жидкости (ацетон, смесь Никифорова). Такая фиксация позволяет избежать грубых деформаций объекта исследования.
4 этап - окраска.
Различают простые и сложные (дифференцирующие) способы окраски. Простые способы позволяют судить о величине, форме, локализации и взаимном расположении клеток. Сложные способы позволяют установить структуру микробов и часто их неодинаковое отношение к красителям. Примером простых способов может служить окраска фуксином (1-2 минуты), метиленовым синим или кристаллвиолетом (3-5 минут), а сложных - окраска по Граму, Романовскому-Гимзе, Циль-Нильсену.
Дифференцирующий метод Грама
После окраски этим методом одни бактерии, окрашиваются в темно-фиолетовый цвет (грамположительные, Гр+). другие - в бордово-красный (грамотрицательные, Гр-). Сущность этого способа окраски состоит в том, что Гр+ бактерии прочно фиксируют комплекс из генцианвиолета и йода, не обесцвечиваясь этанолом. Гр- бактерии после обесцвечивания докрашивают фуксином.
Этапы окраски по Грамму
Материалы. Листья традесканции виргинской (Tradescantia virginica ), подсолнечника (Helianthus annuus ); тычинки из цветков мальвы (Malva sp .), зафиксированные в 90-96%-ном спирте; комплект постоянных микропрепаратов "Анатомия растений"; лактофенол, сернокислый анилин.
Для изучения растительных объектов с помощью светового микроскопа необходимо приготовить микропрепарат. Микропрепараты, не предназначенные для длительного хранения, называются временными . Изучаемый объект помещают на предметное стекло в каплю воды, глицерина, раствора, реактива или красителя и накрывают покровным стеклом. Такие препараты можно хранить в течение нескольких дней, поместив во влажную атмосферу.
Если объекты помещают в бальзам, глицерин с желатиной или целлоидин, препараты сохраняются годами и называются постоянными .
Некоторые растения или их органы (водоросли, споры, пыльца и др.) можно рассматривать под микроскопом целиком, без предварительного изготовления срезов. Такие препараты называются тотальными .
Однако число объектов, которые можно изучать на тотальных микропрепаратах невелико. Чаще приходится делать срезы органов, подлежащих изучению. Срезы изготавливают из свежих или фиксированных частей растений. Обычно для фиксации употребляют растворы спирта или формалина. Сделанные срезы должны быть очень тонкими и прозрачными. Различают следующие виды срезов: поперечный и продольный (радиальный , тангентальный , парадермальный ) (рис. 2, Б).
Поперечный срез проходит перпендикулярно оси органа и позволяет изучить строение органа в поперечном сечении.
Продольный радиальный срез проходит по радиусу оси органа и дает возможность изучить строение органа в продольном сечении.
Продольный тангентальный срез проходит перпендикулярно радиусу цилиндрической структуры, например, корня или стебля; в случае вторичных ксилемы и флоэмы проходит под прямым углом к сердцевинным лучам.
Парадермальный срез (греч. пара + дерма - кожа) - сечение, параллельное поверхности плоской структуры, например, листа (срез эпидермы листа).
Правила изготовления анатомических срезов
Для приготовления временных микропрепаратов необходимо иметь набор предметных и покровных стекол, препаровальные иглы, пипетку, безопасную бритву, скальпель, стеклянную палочку, фильтровальную бумагу, реактивы.
При изготовлении временных микропрепаратов необходимо соблюдать следующую последовательность операций:
Вымыть и тщательно вытереть предметное и покровное стекла. Чтобы не сломать очень хрупкое покровное стекло, надо поместить его в складку салфетки между большим и указательным пальцами правой руки и осторожно вытереть его круговыми движениями пальцев;
Нанести на предметное стекло пипеткой каплю жидкости (воды, глицерина, раствора, реактива или красителя);
Сделать срез изучаемого органа при помощи лезвия. Лезвие должно быть очень острым. Для изготовления срезов, мелкие объекты поместить между кусочками из сердцевины бузины или пенопласта (рис. 2, А). Лезвием выровнить верхнюю поверхность пенопласта вместе с объектом. Затем сделать тонкий срез, ведя лезвием к себе наискось одним плавным и быстрым движением. При этом объект держать строго вертикально, а лезвие - строго горизонтально. Обе руки должны быть совершенно свободны. Не следует ими опираться на стол или прижимать к груди (рис. 3). Сделать сразу несколько срезов. Лезвие и объект все время смачивать.
Выбрать самый тонкий срез, перенести его с помощью препаровальной иглы или тонкой кисточки в центр предметного стекла в каплю жидкости;
Закрыть срез покровным стеклом так, чтобы под него не попал воздух. Для этого покровное стекло взять двумя пальцами за грани и подвести под углом нижнюю грань к краю капли жидкости и плавно его опустить;
Если жидкости много, и она вытекает из-под покровного стекла, удалить ее при помощи фильтровальной бумаги. Если же под покровным стеклом остались места, заполненные воздухом, то добавить жидкость, поместив ее каплю рядом с краем покровного стекла, а с противоположной стороны фильтровальную бумагу.
Рис. 2. Закладка объекта в сердцевину бузины(А) и сечения цилиндрического органа (Б):
1 - поперечное, 2 - продольное радиальное, 3 - продольное тангентальное.
Рис. 3. Положение рук при изготовлении среза.
При необходимости окрашивания препарата реактивом воду из-под покровного стекла отсасывают с помощью фильтровальной бумаги, а капельку реактива наносят с противоположной стороны на край покровного стекла. Реактивами, часто используемыми при окраске растительных препаратов, являются такие:
Йод, растворенный в йодиде калия (для окрашивания крахмальных зерен);
Фуксин (для окрашивания цитоплазмы);
Гематоксилин (для окрашивания ядер);
Хлор-цинк-йод (для окрашивания целлюлозных клеточных оболочек);
Флороглюцин и соляная кислота (для окрашивания одревесневших оболочек);
Глицерин (для просветления препарата) и др.
Ход работы
Задание 1. Приготовить 2 тотальных микропрепарата пыльцы мальвы (Malva sp .): пыльца в воздухе (без покровного стекла) и в лактофеноле. Рассмотреть оба препарата при малом увеличении, отметив особенности сред, в которые помещены пыльцевые зерна. Исследовать строение пыльцы при большом увеличении микроскопа. Сделать рисунок.
Последовательность работы. На середину предметного стекла пипеткой нанести каплю спирта с пыльцой. После высыхания спирта, препарат положить на предметный столик микроскопа и рассмотреть пыльцевые зерна в окружении воздуха. Показатели преломления стекла, воздуха и пыльцы существенно различаются. Поэтому в воздушной среде видны лишь грубые и сильно затемненные элементы структуры. Чтобы избежать не желательных оптических явлений, надо рассмотреть пыльцу в среде, показатель преломления которой близок к показателю преломления стекла. Такой средой служит лактофенол. Стеклянной палочкой на объект нанести каплю лактофенола, затем накрыть его покровным стеклом.
Готовый микропрепарат поместить на предметный столик и исследовать. При малом увеличении видны крупные шаровидные пыльцевые зерна с шиповидными выростами на поверхности (рис. 4). При большом увеличении и перемещении тубуса с помощью микрометренного винта пыльцевые зерна рассмотреть в разных плоскостях: то с поверхности, то в оптическом разрезе. На поверхности пыльцевого зерна хорошо видны выросты стенки. Ближе к периферии они кажутся удлиненными и заостренными, ближе к центру - более шаровидными, а в проекции они имеют вид небольших окружностей. Кроме выростов, на поверхности расположены ростковые поры, через которые в период прорастания пыльцы выходят пыльцевые трубки.
Слегка опустить тубус с помощью микрометренного винта и рассмотреть густое темное внутреннее содержимое (которое отстало от стенки вследствие обезвоживания его спиртом) и две стенки: внутреннюю тонкую - интину и наружную толстую с шаровидными выростами - экзину . После детального исследования при большом увеличении зарисовать одно пыльцевое зерно и обозначить экзину, шиповидные выросты, ростковую пору, интину, внутреннее содержимое.
Рис. 4. Пыльцевое зерно мальвы (Malva sp .) (часть зерна в оптическом разрезе):
1 - экзина, 2 - шиповидный вырост, 3 - ростковая пора (вид сверху), 4 - ростковая пора (вид сбоку), 5 - интина, 6 - внутреннее содержимое.
Задание 2. Приготовить временный препарат парадермального среза эпидермы с нижней стороны листа традесканции виргинской (Tradescantia virginica ) в капле воды, и рассмотреть его под микроскопом.
Последовательность работы. Для изготовления препарата лист традесканции обвернуть вокруг указательного пальца левой руки так, чтобы нижняя сторона фиолетового цвета была обращена наружу. Правой рукой при помощи препаровальной иглы надорвать эпидерму над средней жилкой в средней части листа и пинцетом снять ее кусочек. При этом невольно захватывается и часть мякоти листа (мезофилла), но обычно можно найти тонкий участок на периферии, состоящий из одного ряда клеток эпидермы. Сорванный кусочек положить на предметное стекло в каплю воды наружной стороной вверх и накрыть покровным стеклом. При малом увеличении рассмотреть вытянутые клетки в виде шестиугольников, бесцветные или окрашенные в бледно-фиолетовый цвет благодаря присутствию в вакуолях пигмента антоциана.
Задание 3. Научиться изготовлять разные виды срезов (поперечный, продольный радиальный, продольный тангентальный) из стебля подсолнечника (Helianthus annuus ) и делать из них микропрепараты. Рассмотреть их под микроскопом.
Последовательность работы. Свежесрезанные или фиксированные междоузлия стебля (длиной 2 - 3 см, толщиной 7- 8 мм) разрезать вдоль на 2 части. Невооруженным глазом или с помощью лупы на поперечном сечении стебля можно выделить две зоны: наружную - неоднородную, состоящую преимущественно из плотно сомкнутых клеток, и внутреннюю - рыхлую, построенную однородно.
Поперечные срезы. С выровненной поверхности одной из половинок сделать лезвием несколько поперечных срезов. Эти срезы должны захватить как периферическую часть, так и часть рыхлой сердцевины. С помощью препаровальной иглы или кисточки срез поместить в центр предметного стекла, окрасить его раствором сернокислого анилина, накрыть покровным стеклом и рассмотреть под микроскопом.
Продольные срезы. Для изготовления продольного радиального среза разрезать вдоль кусочек стебля подсолнечника так, чтобы разрез прошел через середину одного из крупных пучков, и с полученного радиального разреза сделать лезвием несколько тонких срезов. Срез поместить на предметное стекло, окрасить сернокислым анилином, накрыть покровным стеклом и рассмотреть под микроскопом.
Для изготовления продольного тангентального среза разрезать кусочек стебля подсолнечника перпендикулярно радиусу стебля, так чтобы он проходил под прямым углом к сердцевинным лучам. Произвести его окрашивание сернокислым анилином.
Одревесневшие оболочки клеток окрасятся в лимонно-желтый цвет.
Задание 4. Рассмотреть несколько постоянных микропрепаратов из комплекта "Анатомия растений". Сравнить временные и постоянные микропрепараты стебля подсолнечника.
Государственное бюджетное образовательное учреждение
Высшего профессионального образования
«Башкирский государственный медицинский университет»
Министерства здравоохранения и социального развития
Российской Федерации
Кафедра фармакогнозии с курсом ботаники и основ фитотерапии
«9» _сентября _____2012 г.
Дисциплина Ботаника Специальность060301 Фармация
Курс1 (очное отделение) Семестр 1
Раздел: «Учение о клетке. Эргастические и секреторные вещества в растительной клетке»
Лабораторная работа № 1
На тему: «Оптические микроскопы. Особенности ботанической микротехники. Осмотические свойства растительной клетки»
Лабораторная работа № 2
На тему: «Строение клеточной стенки. Пластиды, запасные и минеральные включения»
студентов
Уфа 2012
Лабораторная работа № 1
Тема занятия: «Оптические микроскопы. Особенности ботанической микротехники. Осмотические свойства растительной клетки»
1. Актуальность. Изучение приемов ботанической микротехники является необходимым условием для усвоения практических навыков по разделу «Цитология, гистология и анатомия растений». Изучение строения растительной клетки и ее осмотических свойств дает представление о клеточной организации растительных организмов, особенностях строения и отличия от животных.
2. Цели занятия:
1. Приобрести навыки работы с микроскопом;
2. Приобрести навыки приготовления временных микропрепаратов
3. Приобрести навыки ботанической микротехники для микроскопического анализа цельного, резаного и порошкованного лекарственного растительного сырья;
4. Изучить особенности строения растительной клетки
5. Изучить свойства растительной клетки
знать :
· устройство микроскопа и правила работы с ним;
· историю изучения клетки, постулаты клеточной теории;
· строение прокариотической клетки;
· строение эукариотической клетки, ее основных органоидов;
· особенности строения растительной клетки.
Для формирования профессиональных компетенций студент должен уметь :
· приготовить микропрепарат;
· рассмотреть микропрепарат при малом и большом увеличении микроскопа;
· найти органы клетки;
· провести реакции плазмолиза и деплазмолиза, дать теоретическое обоснование;
Для формирования профессиональной компетенции студент должен владеть :
· ботаническим понятийным аппаратом;
· техникой микроскопирования и гистохимического анализа микропрепаратов растительных объектов.
3. Необходимые базисные знания и умения :
· современные представления о строении прокариотической и эукариотической клетки, их отличия.
· устройство микроскопа.
4. Продолжительность внеаудиторной работы – 2 академических часа (90 мин).
Вопросы для самоподготовки:
1. Микроскоп. Механическая и оптическая системы.
2. Правила работы с микроскопом
3. Рабочее расстояние. Разрешающая способность. Общее увеличение.
4. Клетка. История изучения. Клеточная теория
5. Отличие растительной клетки от грибной и животной
6. Строение клетки. Ядро, строение, функции.
7. Органоиды растительной клетки. Строение, функции
8. Цитоплазма. Строение, функции
9. Вакуоль, строение, функции
Пояснение к заданиям
Микроскоп.
Микроскоп - оптико-механическая система, позволяющая получать сильно увеличенное изображение предметов, размеры которых лежат далеко за пределами разрешающей способности невооруженного глаза. Разрешающая способность глаза 0,15 мм. Разрешающая способность световых микроскопов в 300-400 раз выше разрешающей способности невооруженного глаза и равна 0,1-0,3 мкм.
В микроскопе различают оптическую и механическую системы. Оптическая система состоит из осветительного аппарата, объектива и окуляра. Механическая система состоит из револьвера, тубуса, штатива, предметного столика, макро и микровинтов.
Осветительный аппарат включает в себя:
Конденсор (предназначен для наилучшего освещения, регулирования резкости изображения);
Ирисовую диафрагму (предназначена для регулирования диаметра пучка света и глубины поля зрения);
Зеркало (предназначено для направления лучей от источника света в конденсор).
Объектив представляет собой наиболее важную часть оптической системы. Объектив дает изображение объекта с обратным расположением частей. При этом он выявляет («разрешает») структуры, недоступные невооруженному глазу.
Окуляр служит для наблюдения изображения, построенного объективом. Диафрагма окуляра определяет границы поля зрения. В общем, объектив и окуляр и обеспечивают -разрешающую способность микроскопа и определяют общее увеличение микроскопа (общее увеличение микроскопа определяется, как произведение увеличения окуляра объектива).
Механическая система микроскопа предназначена для монтирования частей оптической системы.
Работа с микроскопом
1. Микроскоп установить напротив левого плеча, освободить место перед собой для альбома. Поставить объектив в рабочее положение. О правильности установки объектива следует судить по щелчку, который ощущается при вращении револьвера. Расстояние между объективом и предметным стеклом должно быть около 1 см. Работу с микроскопом всегда начинают с малого увеличения.
2. Открыть полностью диафрагму. Поднять конденсор до уровня предметного столика. Навести свет при помощи вогнутого зеркала так, чтобы все поле было освещено ярко и равномерно.
3. Приготовленный микропрепарат положить на предметный столик так, чтобы один и срезов был расположен точно под объективом. Для фиксации микропрепарата предметное стекло прижать клеммой.
4. С помощью макровинта установить необходимое фокусное расстояние для получения четкого изображения в микроскопе. Откорректировать расстояние микровинтом.
5. Перед переводом микроскопа на большее увеличение выбрать нужное место среза, поставить его в центр поля зрения, и только после этого сменить объективы путем осторожного вращения револьвера.
6. После окончания работы нужно перевести микроскоп на малое увеличение и убрать микропрепарат.
7. После работы микроскоп следует закрыть колпаком для защиты or пыли.
Методика приготовления временных микропрепаратов
1. Объект необходимо взять в левую руку и зажать тремя пальцами, в правой руке надо держать безопасную бритву или лезвие.
2. Поверхность объекта выровнять, чтобы плоскость среза была перпендикулярна оси органа. Срезы делают движением бритвы на себя.
3. На середину предметного стекла пипеткой нанести 2-3 капли воды и на кончике препаровальной иглы перенести наиболее тонкие срезы, закрыть объект покровным стеклом. Жидкость не должна вытекать из-под покровного стекла.
4. Приготовленный препарат положить на предметный столик, рассмотреть при малом и большом увеличениях.
5. Кроме временных препаратов, для исследования объектов используют постоянные препараты. Включающей жидкостью в них является глицерин с желатиной или канадский бальзам.
6. При окрашивании препарата следует учесть, что под действием концентрированных кислот органические включения в клетке могут обуглиться, минеральные включения (кристаллы, друзы, цистолиты) - совсем исчезнуть или изменить свою форму.
7. Нельзя вынимать препарат из-под объектива х40, т.к,. рабочее расстояние его равно 0,6 мм и легко можно испортить фронтальную линзу.
Клетка
Клетка - основная структурная и функциональная единица всего живого. Клетки впервые описал Роберт Гук в середине семнадцатого века (1665 г), рассматривая кусочек пробки. Знания о клетке расширялись с усовершенствованием микроскопа. К середине девятнадцатого века было накоплено достаточно знаний о клетке - открытие ядра, пластид, деления клеток и др. Все знания о клетке были обобщены на рубеже 30-40х г. 19 века ботаником М. Шлейденом и зоологом Т.Шванном в виде клеточной теории.
Главные тезисы (постулаты) клеточной теории:
1. клетка - структурная и функциональная единица всего живого;
2. многоклеточный организм - это сложно организованная, интегрированная система, состоящая из функционирующих и взаимодействующих клеток;
3. все клетки гомологичны по строению;
4. «клетка от клетки». Принцип преемственности клеток путем деления былобоснован в 1958 г. немецким ученым Р. Вирховым.
Форма, строение и размеры клеток очень разнообразны. Растительная клетка состоит из протопласта, оболочки или клеточной стенки и вакуоли .
Протопласт включает: цитоплазму, ядро, пластиды, митохондрии .
Цитоплазма - часть протопласта, заключенная между плазмаллемой и ядром. Основу цитоплазмы составляет ее матрикс, или гиалоплазма – сложная, бесцветная коллоидная система. Важнейшая роль гиалоплазмы заключается в объединении всех клеточных структур в единую систему, обеспечении взаимодействия между ними в процессах клеточного метаболизма. В цитоплазме осуществляется большая часть процессов клеточного метаболизма, кроме синтеза нуклеиновых кислот.
Ядро - обязательная и главная часть живой клетки всех эукариотов. Функции ядра: хранение и воспроизводство наследственной информации, управление обменом веществ и почти всех процессов, происходящих в клетке, синтез нуклеиновых кислот, синтез белка. Ядро окружено оболочкой, состоящей из двух мембран, несущих очень крупные поры. Внутреннее содержимое ядра называется ядерным соком, или нуклеоплазмой. В ядерный сок погружены одно или несколько ядрышек.
Митохондрии органоиды клетки, форма, величина и число которых – постоянно меняются. Основная функция - обеспечение энергетических потребностей клетки путем окисления энергетически богатых веществ (сахаров) и синтеза АТФ и АДФ. Митохондрии окружены двумя мембранами, внутренняя образует выросты - кристы. Митохондрии, как и пластиды, являются полуавтономными органоидами, т.к. содержат в матриксе ДНК и рибосомы.
Пластиды характерны только для растений. Различают три типа пластид: хлоропласты, хромопласты и лейкопласты . Основная функция хлоропластов – фотосинтез, лейкопластов -запасание питательных веществ и хромопластов - окраска цветов и плодов. Хлоропласты состоят из двойной мембраны, матрикса, тиллакоидов, объединенных в граны, ДНК, рибосом, зерен первичного крахмала.
Комплекс Гольджи - система дисковидных мешочков и пузырьков, окруженных мембранами. Выполняет функции синтеза, накопления и выделения некоторых полисахаридов (пектинов, слизей и др.), вторичных метаболитов; образования вакуолей и лизосом; распределения и внутриклеточного транспорта некоторых белков; участвует в построении цитоплазматической мембраны.
ЭПС (эндоплазматическая сеть) – ограниченная мембранами система субмикроскопических каналов. ЭПС подразделяется на гладкую и шероховатую. Функции шероховатой ЭПС: синтез белков; направленный транспорт макромолекул и ионов; образование мембран; взаимодействие органелл. Функция гладкой ЭПС - синтез липофильных соединений.
Вакуоль - полость в клетке, окруженная мембраной (тонопластом), и заполненная клеточным соком. Клеточный сок представляет собой водный раствор различных веществ – продуктов жизнедеятельности протопласта. Функции вакуолей: накопление запасных веществ и шлаков; поддержание тургора клетки; регуляция водно-солевого баланса клетки.
Клеточная стенка отделяет клетку от окружающей среды. Основу ее составляют молекулы целлюлозы, которые сгруппированы в микрофибриллы и фибриллы. Молекулы целлюлозы погружены в матрикс, который состоит из полисахаридов, имеющих более разветвленную структуру - гемицеллюлоз и пектинов, а также воды. Клеточная стенка очень прочная, и в то же время, эластичная. Прочность ей придают молекулы целлюлозы, эластичность - матрикс. Клеточная стенка выполняет формообразующую и механическую функции, обеспечивает защиту протопласта, противостоит высокому осмотическому давлению вакуоли, через клеточную стенку происходит транспорт веществ.
